Нарушение минерализации эмали и гиперкальциемия, вызванные вариантами GNA11

Н. Обтель^*, А. Ле Кабек^*, А.-Л. Лакель^*, А. Аттиа^*, К. Андрик, Ф. Херманс, Ф. Ковачи, Т.Н. Нгуен, А. Шансаван, А. Перко, К. Торренс, Д. Вангу, Ф. Вайсс, М. Гадион, Ф. Саванье, Т. Эдуар, А. Блох-Зупан, Б. Лукич, А. Рак, А. Брюнель, А. Ленглар, Э. Пасман, Ф. Рамирес Роцци, Ф.М. Ханнан, К. Гоше, Т. Корадин, Р.В. Таккер, Ж.-П. Бертоккио^†, К. Шоссен^†

Университет Париж Сите, INSERM U1333 Santé Orale, Стоматологическая школа, Монруж, Франция; и др.

DOI: 10.1177/00220345261470370

Введение

Амелогенез — это строго orchestrated процесс белково-зависимой минерализации, который происходит до прорезывания зуба и является результатом специфического эпителиально-мезенхимального диалога [1]. Несовершенный амелогенез (AI) представляет собой гетерогенную группу наследственных нарушений (ORPHA: 88661, распространённость от 1:700 до 1:14 000), поражающих структуру эмали как молочных, так и постоянных зубов [2]. AI может встречаться как изолированный признак или в сочетании с другими симптомами при синдромах [3]. До настоящего времени AI ассоциировали только с нормальным уровнем кальция в сыворотке или с гипокальциемией. Действительно, у пациентов с генетическими причинами гипокальциемии, такими как витамин D-зависимый рахит или гипопаратиреоз, часто наблюдаются дефекты гипоминерализованной эмали [4]. Однако связи между аномальной минерализацией эмали и гиперкальциемией ранее не сообщалось.

Семейная гипокальциурическая гиперкальциемия (FHH, ORPHA:405) — это генетически гетерогенное аутосомно-доминантное заболевание, которое вызывает гиперкальциемию, умеренную гипермагниемию, нормальную или повышенную концентрацию паратиреоидного гормона и низкую фракционную экскрецию кальция [5]. FHH возникает вследствие гетерозиготных мутаций с потерей функции в трёх генах: CASR (FHH1), GNA11 (FHH2) и AP2S1 (FHH3) [6].

В настоящем исследовании мы поставили целью определить генетическую основу аномальной эмали в двух неродственных гиперкальциемических семьях. Мы идентифицировали новую полную делецию GNA11 в одной семье и новую мутацию сдвига рамки считывания в другой, обе приводящие к гаплоинсуффициентности GNA11 и FHH2. У поражённых лиц эмаль была гипоминерализована, а исследование молочных и постоянных зубов двумя пациентами с помощью мультипрокси-визуализации выявило структурные дефекты эмали.

Материалы и методы

Пациенты

В исследование были включены пациенты в возрасте от 12 до 81 года с семейной гипокальциурической гиперкальциемией, направленные в национальные референсные центры OSCAR. Забор крови и мочи проводился натощак в рамках стандартного наблюдения. Стоматологическое обследование проводилось опытными специалистами (К.Ш. и Ф.В.) и дополнялось внутриротовыми рентгенограммами и панорамными снимками. Наличие дефектов эмали определяли при визуальном осмотре поверхностей зубов, аномалии классифицировали согласно классификациям AI. Индекс DMFT/dft рассчитывали по количеству кариозных, удалённых и запломбированных постоянных и молочных зубов [7].

Образцы зубов

Естественно выпавшие молочные клыки и моляры были собраны у пациентов #2.IV.1 и #2.IV.2. Постоянные третьи моляры были получены от пациента #2.IV.1 в рамках его плана стоматологического лечения. Контрольные зубы соответствующего возраста (от неродственных здоровых лиц) были собраны для различных экспериментов. Зубы собирали с информированного согласия пациентов и их родителей, в соответствии с этическими нормами французского законодательства.

Мыши

Все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями ARRIVE 2.0 и протоколами, одобренными Комитетом по уходу за животными Университета Париж Сите. Для изучения экспрессии Gna11 использовали мышей дикого типа C57BL/6. Модель FHH2 (Tm1b) была создана на основе ресурса EUCOMM/KOMP-CSD [8].

Статистический анализ

Представлены средние значения и стандартные отклонения. Статистические тесты выполняли с помощью XLSTAT и GraphPad Prism. В зависимости от распределения данных использовали непарный t-тест или тест Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия при P ≤ 0,05.

Результаты

Стоматологическое обследование двух семей с гаплоинсуффициентностью GNA11

Основные клинические, стоматологические и биологические характеристики поражённых и здоровых членов двух семей FHH представлены в Таблице 1 и на Рисунке 1.

Таблица 1. Общие и стоматологические клинические данные поражённых и здоровых лиц из двух неродственных семей с FHH2

НД — неопределяемо (эмаль отсутствует, стёрта или заменена пломбой/протезом). Референсные значения: общий Ca 2.15–2.55 ммоль/л; ионизированный Ca 1.15–1.29 ммоль/л.

В семье 1 пробанды — 18-летние монозиготные женские близнецы (#1.II.3 и #1.II.4) — имели гетерозиготную делецию 289 т.п.н. в хромосоме 19q13.3, затрагивающую 6 генов, включая GNA11. У обеих выявлена гипоминерализованная эмаль с локальными опалесцирующими участками. В семье 2 пробанд (#2.IV.1) — 16-летний юноша с мутацией c.52_54delinsCGATGAGGTG p.(Ser18Argfs*2) — имел гипоминерализованную эмаль с генерализованными меловидными белыми участками и активными кариозными поражениями. Его 10-летняя кузина (#2.IV.2) с той же мутацией также имела гипоминерализованную эмаль.

Анализ зубов пациентов с гаплоинсуффициентностью GNA11

Микро-компьютерная томография (микро-КТ) показала нормальную морфологию коронок и толщину эмали по сравнению с контрольными зубами. Однако синхротронная сканирующая микроскопия выявила множественные участки аномально минерализованной эмали в зубах пациентов с FHH2. Растровая электронная микроскопия (СЭМ) подтвердила наличие изменённых участков в эмали, где эмалевые призмы выглядели эродированными, что говорит о повышенной кислотной лабильности.

Энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия (EDS) показала небольшое снижение содержания кальция (Ca) и фосфора (P), а также снижение соотношения Ca/P в эмали FHH2. Рамановская микро-спектроскопия подтвердила потерю минерального компонента в дефектных участках. TOF-SIMS выявила снижение содержания кальция и повышение содержания аминокислот (белков) в дефектных участках, что указывает на неполное замещение органического матрикса минералом.

В дентине также обнаружены дефекты минерализации в виде интерглобулярных пространств — участков, где не произошло слияния калькосферитов.

Экспрессия GNA11 в развивающемся зубе

Публичные атласы одноклеточной транскриптомики показали, что GNA11 экспрессируется как в эпителии, так и в мезенхиме зуба. RT-qPCR подтвердила экспрессию Gna11 в секреторных и созревающих амелобластах, а также в одонтобластах. RNAscope с флуоресцентным зондом выявил мРНК Gna11 в этих клетках. Иммунофлуоресценция показала наличие белка Gα11 на апикальном конце амелобластов и в одонтобластах. Вестерн-блот подтвердил наличие белка Gα11 в лизатах зачатков моляров и резцов.

Фенотип эмали мышиной модели FHH2

У гетерозиготных мышей (Gna11Tm1b^+/−) наблюдались белые обесцвеченные резцы по сравнению с дикими littermates. Микро-КТ показала задержку начала минерализации эмали в постоянно растущих резцах, что приводило к значительному снижению объёма и плотности эмали. Аналогичные изменения обнаружены в молярах верхней и нижней челюстей. СЭМ выявила дефекты эмали в резцах и первых молярах мутантных мышей.

Обсуждение

Настоящее исследование впервые сообщает о стоматологических дефектах у пациентов с гиперкальциемией вследствие герминативных мутаций GNA11 с потерей функции. Мы описываем гипоминерализованную эмаль у поражённых членов двух неродственных семей с FHH2. Анализ фенотипа эмали мышиной модели FHH2 выявил задержку минерализации эмали в постоянно растущем резце и гипоминерализованную эмаль с дефектами в резцах и молярах, что соответствует находкам у пациентов с FHH2 и предполагает несовершенный амелогенез.

Ранее аномальная эмаль чаще всего описывалась у пациентов с генетической гипокальциемией. Поэтому мы не ожидали обнаружить гипоминерализованную эмаль у пациентов с наследственной лёгкой гиперкальциемией, учитывая, что поставка кальция во время минерализации тканей зуба должна быть достаточной. Наши данные показывают, что как гипокальциемические, так и гиперкальциемические генетические состояния могут ассоциироваться с гипоминерализованной эмалью.

Учитывая, что GNA11 экспрессируется в амелобластах и одонтобластах, можно предположить, что в этих клетках Gα11 активирует PLCβ, приводя к генерации инозитол-1,4,5-трифосфата (IP3) и последующему IP3-опосредованному высвобождению ионизированного кальция из эндоплазматического ретикулума. Изменения внутриклеточной концентрации кальция регулируют экспрессию генов, участвующих в амелогенезе.

Поскольку фенотип эмали различался между двумя семьями, нельзя исключить вовлечение второго делегированного гена в локусе GNA11 в семье 1. Интересно, что инактивация Nfic вызывает дентинную дисплазию у мышей, а его делеция или гиперэкспрессия нарушает амелогенез.

Заключение

Исследование выявляет дефекты эмали как новый фенотип FHH2 и подчёркивает необходимость включения стоматолога в мультидисциплинарную команду по ведению семей с наследственной гиперкальциемией, поскольку некоторые пациенты могут иметь патогенные варианты в ещё не идентифицированных генах, вызывающих несовершенный амелогенез.

Список литературы

1. Jernvall J, Thesleff I. Reiterative signaling and patterning during mammalian tooth morphogenesis. Mech Dev. 2000;92(1):19-29.
2. Bloch-Zupan A, et al. Amelogenesis imperfecta: next-generation sequencing sheds light on Witkop's classification. Front Physiol. 2023;14:1130175.
3. de La Dure-Molla M, et al. Elements of morphology: standard terminology for the teeth and classifying genetic dental disorders. Am J Med Genet A. 2019;179(10):1913-1981.
4. Kovacs CS, et al. The role of biomineralization in disorders of skeletal development and tooth formation. Nat Rev Endocrinol. 2021;17(6):336-349.
5. Newey PJ, Hannan FM, Wilson A, Thakker RV. Genetics of monogenic disorders of calcium and bone metabolism. Clin Endocrinol (Oxf). 2022;97(4):483-501.
6. Hannan FM, Babinsky VN, Thakker RV. Disorders of the calcium-sensing receptor and partner proteins: insights into the molecular basis of calcium homeostasis. J Mol Endocrinol. 2016;57(3):R127-R142.
7. Poulsen S, et al. Amelogenesis imperfecta—a systematic literature review of associated dental and oro-facial abnormalities and their impact on patients. Acta Odontol Scand. 2008;66(4):193-199.
8. Hannan F, et al. OR30-5 Germline ablation of G-protein subunit alpha-11 in mice causes hypercalcemia that is rectified by treatment with cinacalcet. J Endocr Soc. 2019;3(suppl 1):OR30-5.

Статья опубликована в Journal of Dental Research (2026). DOI: 10.1177/00220345261470370